1. 核酸提取的基本原理
核酸提取是分子生物学实验中的基础步骤，其核心目标是从细胞或组织中分离出高质量的DNA或RNA。提取过程主要依赖于细胞膜破裂、蛋白质变性及核酸纯化三个关键环节。细胞裂解通常通过机械破碎、化学试剂（如SDS）或酶解（如蛋白酶K）实现，随后利用酚-氯仿等有机溶剂去除蛋白质，最后通过乙醇沉淀或柱式纯化获得核酸。该过程的效率直接影响下游实验（如PCR、测序）的准确性。
在实际操作中，实验人员需根据样本类型选择合适的方法。例如，植物组织因含多糖多酚，需加入PVP等抑制剂；而动物组织则更注重裂解速度和核酸完整性。此外，RNA提取需严格避免RNase污染，通常在操作前对器械进行DEPC处理。
2. 常用核酸提取方法分类
目前主流的核酸提取方法可分为三类：酚-氯仿法、磁珠法和柱式法。酚-氯仿法作为传统方法，通过有机溶剂分层实现核酸与蛋白质分离，具有成本低、通量高的优势，但存在操作繁琐、毒性风险等问题。磁珠法利用带电磁珠与核酸结合的特性，通过磁力快速分离，适用于自动化平台，但对样本量要求较高。柱式法则基于硅基膜的选择性吸附原理，操作简便且核酸回收率稳定，是当前实验室最常用的技术。
| 方法类型 | 优点 | 缺点 | 适用场景 |
|---|---|---|---|
| 酚-氯仿法 | 成本低，适配复杂样本 | 操作繁琐，存在毒性 | 科研基础实验 |
| 磁珠法 | 快速高效，可自动化 | 设备依赖性强 | 高通量检测 |
| 柱式法 | 操作简便，重复性好 | 成本较高 | 常规实验室 |
3. 核酸提取的关键步骤详解
细胞裂解是提取流程的起始步骤，需根据样本特性选择裂解液。动物组织推荐使用含SDS的裂解液，而植物样本需额外添加β-巯基乙醇以分解细胞壁。裂解完成后需加入蛋白酶K消化蛋白质，此步骤需控制温度和时间，通常在56℃孵育30分钟。
核酸沉淀环节中，异丙醇或乙醇的加入浓度直接影响沉淀效率。RNA提取推荐使用异丙醇（0.5-1倍体积），而DNA提取则可采用乙醇（2倍体积）。沉淀后的核酸需用75%乙醇洗涤2次以去除盐分，最后在超净工作台中干燥。
洗脱
4. 不同样本类型的优化策略
血液样本提取需注意溶血液红蛋白的干扰，建议在裂解液中加入柠檬酸钠。植物样本因富含多糖多酚，可添加PVP（聚乙烯吡咯烷酮）和CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）进行抑制。对于细菌样本，推荐使用溶菌酶预处理以破坏细胞壁。
特殊样本如真菌或古菌，其细胞壁结构复杂，需采用机械破碎（如珠磨法）结合酶解。临床样本（如痰液、粪便）则需增加离心步骤以去除杂质，同时调整裂解液pH值以提高核酸释放效率。
5. 核酸质量评估与常见问题
提取完成后需通过分光光度计和电泳进行质量检测。DNA纯度标准为A260/A280=1.8，RNA则为2.0。若比值偏低，可能由蛋白质残留或RNase污染导致。电泳图谱中DNA应呈现清晰条带，RNA则需观察28S和18S条带的完整性。
常见问题及解决方案：
- 核酸降解：检查操作环境是否带入RNase，建议全程佩戴手套并使用无RNase耗材。
- 提取量不足：增加裂解液用量或延长裂解时间，避免过度离心导致核酸损失。
- 溶解困难：使用TE缓冲液（10mM Tris-HCl, 1mM EDTA）而非纯水进行洗脱。
6. 新型提取技术发展趋势
随着生物技术进步，微流控芯片提取和纳米材料富集成为研究热点。微流控技术通过微型化反应单元实现高通量处理，纳米材料（如氧化石墨烯）则利用大比表面积提高核酸吸附效率。这些技术正在推动核酸检测向床旁检测（POCT）方向发展。
在环境样本处理中，直接裂解法省去了传统提取步骤，通过特殊裂解液实现”样本到检测”的一体化操作。该技术特别适用于现场快速检测，但需配套专用的PCR仪器。
原创文章，作者：墨香轩，如若转载，请注明出处：https://www.psecc.com/p/97615/
